Naukowcy z Uniwersytetu Wrocławskiego opracowali nową strategię celowanej terapii nowotworów. Chcą wykorzystać mechanizm, który dotąd był przeszkodą

Badacze zaproponowali sposób na ominięcie jednego z podstawowych ograniczeń współczesnych terapii celowanych. Zamiast szukać celu molekularnego występującego wyłącznie na komórkach nowotworowych, postanowili przejąć kontrolę nad procesem wchłaniania leku przez komórkę. Co istotne, chcą nim sterować jednocześnie od zewnątrz i od wewnątrz komórki.

Wyniki badań zostały opublikowane w Journal of the American Chemical Society. Pierwszymi autorami publikacji są doktoranci Zakładu Biotechnologii Medycznej Uniwersytetu Wrocławskiego – Aleksandra Chorążewska i Krzysztof Ciura.

Dlaczego celowanie w raka jest tak trudne?

Jednym z kierunków współczesnej onkologii są koniugaty lek–przeciwciało (ADC) oraz lek–białko (PDC). Ich działanie można w uproszczeniu porównać do systemu składającego się z „wyszukiwacza” i silnego ładunku.

Pierwszy element ma rozpoznać określony antygen znajdujący się na powierzchni komórki nowotworowej. Drugi stanowi silny lek cytotoksyczny, którego zadaniem jest zniszczenie komórki od środka. Żeby jednak ładunek mógł zadziałać, komórka musi najpierw wchłonąć przyłączoną do jej powierzchni cząsteczkę. Proces ten nazywany jest endocytozą.

Problem pojawia się wtedy, gdy potencjalny cel znajduje się nie tylko na komórkach raka, ale również na zdrowych tkankach. W takiej sytuacji jego wykorzystanie może prowadzić do uszkodzenia prawidłowych komórek. Dlatego liczba celów molekularnych spełniających wymagania klasycznych terapii celowanych jest ograniczona.

To właśnie ten problem postanowili obejść naukowcy z Wrocławia.

HSPG – cel, którego wcześniej nie można było bezpiecznie wykorzystać

Badacze skierowali swoją uwagę na proteoglikany heparanosiarczanowe, czyli HSPG. Są to złożone cząsteczki cukrowo-białkowe, które obficie występują m.in. na powierzchni komórek raka trzustki.

HSPG nie są jednak charakterystyczne wyłącznie dla komórek nowotworowych. Występują również na wielu zdrowych komórkach. Z tego powodu według klasycznych zasad terapii celowanych nie były dobrym kandydatem na cel dla koniugatów ADC/PDC.

Wrocławski zespół zaproponował więc zmianę podejścia. Zamiast próbować znaleźć receptor obecny tylko na komórkach raka, naukowcy skupili się na tym, jak komórka reaguje na związanie cząsteczki i w jaki sposób ją wchłania.

To właśnie kontrola tego procesu stała się kluczowym elementem opracowanej strategii.

TriFHS-MMAE ma wymuszać szybkie wchłanianie leku

Naukowcy zaprojektowali specjalny, wielowartościowy koniugat TriFHS-MMAE. Jego konstrukcja została opracowana tak, aby nie tylko rozpoznać HSPG, ale również silnie połączyć wiele znajdujących się obok siebie łańcuchów heparanosiarczanowych.

Wykorzystano w tym celu specyficzne rusztowania oligomeryzacyjne, w modelowej wersji oparte na strukturach określanych jako wielokąty GFPp, oraz przeprogramowany czynnik wzrostu fibroblastów FGF1.

Tak skonstruowana cząsteczka powoduje klastrowanie łańcuchów heparanosiarczanowych na powierzchni komórki. Ten swoisty „multidotykowy uścisk” uruchamia gwałtowny proces wchłaniania koniugatu – endocytozę zależną od agregacji, określaną skrótem ADE.

To istotna różnica w porównaniu z klasycznym podejściem. Zespół nie opiera się wyłącznie na naturalnej aktywności receptora, ale projektuje cząsteczkę w taki sposób, aby aktywne wymuszenie jej internalizacji było częścią konstrukcji leku.

Po wchłonięciu TriFHS-MMAE wraz z kompleksem receptorowym jest transportowany przez endosomy do lizosomów. Tam koniugat ulega degradacji, uwalniając wewnątrz komórki cytotoksyczny ładunek MMAE.

Dodatkową właściwością zastosowanych struktur GFPp jest fluorescencja. Dzięki niej możliwe jest śledzenie transportu koniugatu zarówno w komórkach, jak i w całym organizmie.

Problem zdrowych komórek i pomysł na „wyłącznik bezpieczeństwa”

Samo skierowanie koniugatu na HSPG nie wystarczało jednak do uzyskania odpowiedniej selektywności. Skoro HSPG znajdują się również na zdrowych komórkach, także one mogły pobierać TriFHS-MMAE.

Badacze musieli więc znaleźć sposób na rozróżnienie komórek zdrowych i nowotworowych nie poprzez sam cel znajdujący się na ich powierzchni, ale poprzez wewnętrzne mechanizmy sterujące procesem endocytozy.

W tym celu wykorzystali wysokoprzepustowy screening, czyli technologię High Content Screening (HCS), oraz bibliotekę inhibitorów obejmującą niemal cały kinom. Pozwoliło to zidentyfikować szlaki sygnałowe regulujące endocytozę ADE związaną z HSPG w komórkach trzustki.

Kluczowe okazało się odkrycie, że transformacja nowotworowa głęboko zmienia wewnętrzną organizację sygnałów w komórce. W rezultacie zdrowe i złośliwe komórki wykorzystują odmienne kaskady kinaz do regulowania tego samego procesu wchłaniania.

To stworzyło możliwość zastosowania drugiego elementu strategii – tzw. primingu.

Priming ma zamknąć „bramy” w zdrowych komórkach

Priming oznacza w tym przypadku wcześniejsze przygotowanie komórek za pomocą odpowiednio dobranego inhibitora kinaz.

Jego działanie jest różne w zależności od rodzaju komórki. W komórkach zdrowych inhibitor blokuje wewnętrzne szlaki sygnałowe odpowiadające za endocytozę ADE. W efekcie ogranicza możliwość wchłonięcia koniugatu i chroni prawidłowe komórki przed jego toksycznym działaniem.

W komórkach nowotworowych sytuacja wygląda inaczej. Ten sam inhibitor nie blokuje wchłaniania TriFHS-MMAE, a w wielu przypadkach może wręcz zwiększać jego internalizację. Oznacza to, że substancja wykorzystywana do ochrony zdrowych komórek może jednocześnie zwiększać pobieranie leku przez komórki nowotworowe.

W ten sposób naukowcy połączyli dwa mechanizmy: zewnętrzne sterowanie zachowaniem cząsteczki oraz wewnętrzne sterowanie odpowiedzią komórki.

Dwa poziomy kontroli zamiast jednego „idealnego” celu

To właśnie ten element stanowi najważniejszą ideę opracowanej strategii.

Pierwszy poziom działa na powierzchni komórki. Odpowiednio zaprojektowany TriFHS-MMAE wiąże HSPG i wymusza ich agregację, uruchamiając szybką endocytozę.

Drugi poziom znajduje się wewnątrz komórki. Odpowiednio dobrany inhibitor wykorzystuje różnice w szlakach sygnałowych zdrowych i nowotworowych komórek. W zdrowych komórkach ogranicza wchłanianie koniugatu, a w komórkach nowotworowych go nie blokuje, a w wielu przypadkach dodatkowo wzmacnia.

Dzięki temu badacze nie muszą wymagać, aby cel molekularny występował wyłącznie w komórkach raka. Selektywność terapii ma być osiągana poprzez kontrolowanie procesu, który następuje po rozpoznaniu celu.

To zmienia sposób myślenia o tym, jakie struktury można potencjalnie wykorzystywać w terapiach celowanych.

Wyniki potwierdzono w badaniach na zwierzętach

Skuteczność opracowanej strategii została potwierdzona w badaniach przedklinicznych in vivo. U zwierząt, u których zastosowano priming odpowiednio dobranym modulatorem endocytozy, zaobserwowano istotne zmniejszenie niespecyficznego gromadzenia się TriFHS-MMAE w zdrowych komórkach, tkankach i narządach bogatych w HSPG.

Według materiału wykorzystanie takiej strategii może również ograniczać ryzyko rozwoju oporności na leczenie. Wynika to z faktu, że koniugat kierowany jest na cukrowe komponenty HSPG, czyli łańcuchy heparanosiarczanowe, a nie wyłącznie na część białkową.

Ważnym elementem opracowania jest także możliwość śledzenia koniugatu dzięki jego właściwościom fluorescencyjnym. Pozwala to obserwować jego zachowanie na poziomie pojedynczych komórek oraz w całym organizmie.

Co może oznaczać to odkrycie?

Badania zespołu z Uniwersytetu Wrocławskiego pokazują, że w terapiach celowanych można potencjalnie wykorzystać również cele molekularne, które dotąd uznawano za zbyt powszechne. Sterowanie procesem wchłaniania leku, a nie tylko poszukiwanie antygenu występującego wyłącznie na komórkach raka, może otworzyć nowe możliwości leczenia nowotworów, m.in. raka trzustki. Dodatkowym ułatwieniem może być wykorzystanie inhibitorów już znanych i testowanych klinicznie w onkologii.

To jeszcze nie jest terapia dla pacjentów

Opracowana metoda jest obecnie na etapie badań przedklinicznych. Wyniki uzyskane na zwierzętach są obiecujące, ale przed rozpoczęciem badań klinicznych konieczne są dalsze analizy dotyczące jej bezpieczeństwa i skuteczności u ludzi. Naukowcy podkreślają jednak, że ich odkrycie otwiera obiecujący kierunek rozwoju multimodalnych terapii celowanych, które mają zwiększać skuteczność leczenia przy jednoczesnym ograniczeniu działań niepożądanych.

Wyniki badań zostały opublikowane w prestiżowym czasopiśmie Journal of American Chemical Society, pierwszymi autorami pracy są doktoranci z Zakładu Biotechnologii Medycznej Uniwersytetu Wrocławskiego: Aleksandra Chorążewska i Krzysztof Ciura:

Priming Cells with Modulators of Cellular Signaling Ensures Enhanced Selectivity of HSPG-Specific Protein–Drug Conjugate Delivery | Journal of the American Chemical Society | ACS Publications

Badania zostały sfinansowane przez Narodowe Centrum Nauki w ramach grantu OPUS-22 przyznanego prof. Łukaszowi Opalińskiemu.